ÿþTwee representatieve immunokleuring gliomen worden getoond in Fig. 2b puma sneakers heren waarin een GBM (bovenste paneel) positieve kleuring vertoont voor zowel EGFR / EGFRvIII en PUMA en, in tegenstelling, een klasse II glioma (onderste paneel) kleurt negatief voor beide eiwitten. Het antilichaam dat wordt gebruikt in de EGFR / EGFRvIII IHC herkent een C-terminaal epitoop dat aanwezig is in zowel EGFR- als EGFRvIII-receptoren, en opeenvolgende tumorcoupes werden in deze onderzoeken gebruikt. De hoge mate van EGFR / EGFRvIII-PUMA-co-expressie in primaire GBM-monsters is consistent met de waarnemingen in Fig. 1 met de GBM-cellijnen. In overeenstemming met de resultaten in Fig. S1 werd gevonden dat een subpopulatie van GBM's PUMA tot expressie bracht, maar geen substantiële niveaus van EGFR / EGFRvIII.

In de test vertegenwoordigen de gele samengevoegde signalen nucleair gefragmenteerd DNA. Zoals verwacht, vertoonden onbehandelde cellen geen bewijs van apoptose (gegevens niet getoond). De western blotting (Fig. 3b) gaf puma schoenen dames aan dat PUMA-expressie specifiek en efficiënt werd gereguleerd door de PUMA-specifieke siRNA. Effecten van PUMA-expressie down-regulatie en verhoogde EGFRvIII-expressie op de inductie van apoptose in GBM-cellen. De mate van apoptose wordt berekend als: (# apoptotische kernen) / (totaal van kernen). In beide panelen werden 250-300 cellen onderzocht in puma platform elk experiment en drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd om middelen en standaardafwijkingen af   te leiden.

MDA-MB-468-cellen, waarvan bekend is dat ze hoge niveaus van endogene EGFR tot expressie brengen [34], werden behandeld met en zonder staurosporine, gefractioneerd in mitochondriale en niet-mitochondriale fracties en eiwitextracten geanalyseerd zoals eerder beschreven. PUMA is voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma van deze cellen, onder onstressieve en gestresste omstandigheden, zoals aangegeven door de lage mtPUMA-indices. EGFR en EGFRvIII bestaan   beide in complex met PUMA constitutief en de interacties worden onderhouden onder apoptotische stress. U87MG-EGFR en U87MG-EGFRvIII stabiele transfectanten en puma slippers T98G GBM-cellen met endogene EGFR werden behandeld met 1% DMSO en 1 uM apoptose-inductor staurosporine (ST).

Naast GBM-cellen hebben we gevonden dat PUMA gelokaliseerd is in het cytoplasma van MDA-MB-468 menselijke borstkankercellen (Fig. 5d) waarvan bekend is dat ze significante niveaus van endogene EGFR tot expressie brengen [34]. Samen tonen deze resultaten aan dat PUMA wordt gesekwestreerd in het cytoplasma van EGFR- en EGFRvIII-expressie GBM en borstkankercellen, constitutief en onder apoptotische stress. Om inzicht te krijgen in de factoren die de interactie van EGFR met PUMA moduleren, hebben we de eis onderzocht van EGFR-activering voor de EGFR-PUMA-interactie. Fig. 6a (linkerpaneel) laat zien dat het vermogen van EGFR om te binden aan PUMA vergelijkbaar was in U87MG-EGFR-cellen met en zonder EGF-stimulatie na serumhongering.

EGFR-kinase-activiteit is niet vereist voor hun interactie met PUMA. U87MG-EGFR-cellen behandeld met en zonder Iressa (25 uM) gedurende 2 uur werden onderworpen aan immunoprecipitatie / western blotting (linker paneel) en western blotting (rechter paneel). Controle IgG leverde geen signalen op die specificiteit aangeven. Behandelingen met Iressa remden effectief EGFR-kinase-activiteit, maar hadden geen significante invloed op de interactie tussen EGFR / EGFRvIII en PUMA, hetgeen aangeeft dat de interactie geen puma basket EGFR-kinase-activiteit vereiste. (C) Anti-apoptotische eiwitten Bcl-2 en Bcl-xL komen sterk tot expressie in de meeste GBM-cellijnen.

Western blotting werd uitgevoerd om expressieniveaus voor anti-apoptotische leden van de Bcl-2-familie van eiwitten te bepalen. Blijkbaar komen Bcl-2 en Bcl-xL sterk tot expressie in de meerderheid van de geanalyseerde GBM-cellijnen, maar niet Mcl-1. (D) Herstel van intrinsieke apoptose sensibiliseert EGFR / EGFRvIII tot expressie brengende GBM-cellen voor EGFR-gerichte therapie. U87MG-EGFR- en U87MGEGFRvIII-cellen werden behandeld met alleen Iressa (0-100 uM), 2-MA A3 (een Bcl-2 / Bcl-xL-remmer en een krachtige apoptose-inductor; 0-100 uM) alleen en in combinatie met de molverhouding van 1: 2 (Iressa: 2-MA A3).