U87MG-Zellen wurden puma basket heart black mit Kontroll-siRNA und PUMA-spezifischer siRNA 24 Stunden lang transfiziert und 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin, einem wirksamen Apoptose-Induktor, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Rote Fluoreszenz: mit Propidiumiodid gefärbte Kerne. Grüne Fluoreszenz: fragmentierte DNA. Gelbe fusionierte Signale: Kernfragmentierte DNA. (B) Western Blot zeigt einen spezifischen und effizienten PUMA-Expressions-Knockdown nach der Transfektion von PUMA-spezifischer siRNA an, jedoch keine Kontrolle von nicht zielgerichteter siRNA. (C) Eine erhöhte EGFRvIII-Expression verleiht GBM-Zellen eine Resistenz gegen Apoptose.

Im Gegensatz dazu war PUMA in U87MG-Vektorzellen mit sehr geringer EGFR-Expression ausschließlich in den mitochondrialen Fraktionen unabhängig von apoptotischem Stress vorhanden (5b). Die Wirksamkeit der Zellfraktionierung wird durch das Fehlen des cytoplasmatischen Markers puma basket heart damen ±-Tubulin in den mitochondrialen Extrakten und das Fehlen des mitochondrialen Markers Cox IV in den nichtmitochondrialen Extrakten angezeigt.

PUMA ist im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen unabhängig von apoptotischem Stress sequestriert. Das Ausmaß der mitochondrialen PUMA-Translokalisierung, mtPUMA-Index, puma basket heart kinder wird wie unter Materialien und Methoden beschrieben berechnet. (A) PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen lokalisiert. Mit Vehikelkontrolle, Staurosporin (ST, 1 uM) oder Anisomycin (AN, 100 ng / ml) behandelte U87MG-EGFRvIII-Zellen wurden geerntet und in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert. Proteinextrakte aus beiden Fraktionen wurden einem Western Blot unterzogen, um PUMA, ±-Tubulin (cytoplasmatischer Marker) und Cox IV (mitochondriales Protein) nachzuweisen.

Das Fehlen von ±-Tubulin und Cox IV in den mitochondrialen bzw. nicht mitochondrialen Fraktionen zeigte die Wirksamkeit der puma basket heart patent Fraktionierung an. Niedrige mtPUMA-Indizes deuten darauf hin, dass PUMA hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter ungestressten und gestressten Bedingungen lokalisiert ist. (B) PUMA ist ausschließlich in den mitochondrialen Fraktionen von U87MG-Vektorzellen lokalisiert. U87MG-Vektorzellen wurden behandelt, fraktioniert und Proteine   analysiert, wie zuvor in Panel a beschrieben. Die mtPUMA-Indizes in diesen Zellen sind 1,0, was darauf hinweist, dass PUMA unabhängig von apoptotischem Stress ausschließlich in den Mitochondrien dieser Zellen nachgewiesen wird. (C) Der Abbau der EGFR-Expression durch siRNA führt zu einer erhöhten mitochondrialen Translokalisierung von PUMA.

In Kontroll-siRNA-behandelten natürlichen T98G-GBM-Zellen ist PUMA hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. In EGFR-spezifischen siRNA-behandelten Zellen beobachteten wir einen deutlichen Anstieg des mitochondrialen PUMA (linkes Feld). EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (rechtes Feld). Lamin B: Kernprotein. ME: mitochondriale Extrakte. NME: nicht mitochondriale Extrakte. (D) PUMA wird puma basket heart sale im Zytoplasma EGFR-exprimierender menschlicher Brustkrebszellen sequestriert. MDA-MB-468-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie hohe Mengen an endogenem EGFR exprimieren [34], wurden mit und ohne Staurosporin behandelt, in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert und Proteinextrakte wie zuvor beschrieben analysiert.

EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (5c-rechts). Zusätzlich zu GBM-Zellen fanden wir, dass PUMA im Zytoplasma von menschlichen MDA-MB-468-Brustkrebszellen lokalisiert ist (5d), von denen bekannt ist, dass sie signifikante Mengen von endogenem EGFR exprimieren [34]. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass PUMA im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen konstitutiv und unter apoptotischem Stress sequestriert wird.

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